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LO STUDIO DI TOMASETTI E VOGELSTEIN

La Casualità dei Tumori

Scritto il 27 Gennaio 2015.

di: Francesco Mauro

Nelle settimane scorse, ha ricevuto notevole attenzione, sulla stampa internazionale e sui media, la notizia del lavoro scientifico, pubblicato sulla rivista americana Science, che sottolinea come il caso sia il fattore più rilevante, rispetto ad altri, nell’indurre l’insorgenza di tumori nell’uomo. Gli autori propongono che una frazione consistente dei tumori sia correlata al numero totale di divisioni di cellule staminali di un determinato tessuto. Circa 2/3 dei tumori sarebbe quindi dovuta, come dimostrato dalla forte correlazione osservata, a mutazioni casuali, ed il rimanente terzo a fattori ambientali e a predisposizione ereditaria.

Scopo del presente contributo è non soltanto quello di illustrare un nuovo lavoro scientifico sull’origine dei tumori e di informare sulle reazioni a quanto sostenuto dagli autori di tale lavoro, ma anche quello di mettere in evidenza come l’argomento specifico rientri in un filone di ricerca nato addirittura nell’800 ed affermatosi intorno alla metà del secolo scorso, con il riconoscimento delle basi cellulari – ed oggi molecolari – della medicina moderna. Nel caso nostro, si tratta in particolare delle differenze cellulari tra i vari tessuti e organi del corpo, con le conseguenti differenze morfologiche e funzionali (embriogenesi, organogenesi, sistemi cellulari, proliferazione, reclutamento, ripopolamento, senescenza).

In particolare, viene analizzato il ruolo delle cellule staminali (emerso a partire dalla metà degli anni ’50, ma portato all’attenzione del grosso pubblico solo in anni recenti, con una discussione a carattere etico), le quali sono particolarmente sensibili ai fenomeni che hanno effetto sulla divisione cellulare e sulla proliferazione delle popolazioni cellulari. Le ricerche che verranno qui descritte non risulteranno quindi inerenti ad una o più anomalie specifiche, ma indicatrici di fenomeni chiave nel funzionamento dell’organismo.

I due autori dell’articolo di cui sopra sono Cristian Tomasetti e Bert Vogelstein, un biomatematico e un genetista oncologo della Johns Hopkins University di Baltimore, nel Maryland, una delle migliori università americane. Il lavoro si intitola (tradotto dall’inglese) “La variazione del rischio di tumori in diversi tessuti può essere spiegata in base al numero di divisioni delle cellule staminali” ed è stato pubblicato su Science dopo il parere in incognito di almeno due esperti della materia (peer review) e con il probabile coinvolgimento e interazione tra autori, revisori e curatore. Science (che viene pubblicata dall’American Association for the Advancement of Science) è considerata, insieme a Nature (inglese), la migliore rivista scientifica a livello internazionale tra quelle di tipo generalista.  In essa vengono pubblicati articoli autorevoli e importanti in discipline diverse: non si tratta quindi di una rivista propriamente specialistica, ma piuttosto di una sede che ospita contributi (review lunghe o lettere brevi) che segnalano proposte di cambiamento nel panorama scientifico. 

Il cancro oggi
Le ricerche per aumentare e migliorare le conoscenze su questa terribile malattia o gruppo di malattie nota come cancro – il “male incurabile” innominato nei necrologi che aveva sostituito nell’immaginario popolare la peste nera e le altre malattie infettive – hanno segnato lo sviluppo della medicina moderna. I progressi, dapprima minimi ma costanti, hanno riguardato nel secondo dopoguerra la patologia, la diagnostica (compresa la medicina nucleare, gli anticorpi monoclonali e la citometria a flusso) e le terapie: chirurgiche, radioterapiche, chemioterapiche e he, chemioterapiche, radioterapicheimmunoterapiche.

Oggi siamo sulla soglia delle terapie molecolari, ma, nel frattempo, nei paesi industrializzati, il rateo di sopravvivenza complessivo a 5 anni per i tumori è passato da circa 33 nel 1960 a 56 nel 1988, a 67 nel 2007, con punte dell’81 per certe zone nel 2009. Il rateo di sopravvivenza per i tumori è l’indice più usato su popolazioni di pazienti: esso può venire impiegato in riferimento ad una sopravvivenza per 1, 3, 5, 10, 15, 25 anni o, in effetti, qualsiasi durata si voglia più opportunamente analizzare; in generale, si usa la durata di 5 anni (come per i valori qui sopra riportati; ad esempio, il valore di 33 nel 1960 significa che allora 33% dei pazienti sopravviveva almeno 5 anni dopo la prima diagnosi. Naturalmente, il rateo può essere evidenziato per tutti i tumori, per un tipo specifico di tumore, per uno stadio o un grado istologico o altro. Per esempio, nel caso del carcinoma polmonare il rateo di sopravvivenza a un anno è 20, a 5 anni è 6, a 10 anni è 5.

In sintesi, in modo approssimativo, si può dire che, per la sopravvivenza a 5 anni, per tutti i tumori, in circa trent’anni di ricerche si è ottenuto un raddoppio della percentuale di sopravvivenza e poi un altro consistente aumento nei successivi 20 anni. I tumori non sono più la prima causa di morte in questi paesi, sostituiti dalle malattie cardio-vascolari (e dalle malattie infettive vecchie e nuove in alcuni paesi in via di sviluppo). Va però tenuto presente che la frazione di popolazione con malattia neoplastica dove si muore ancora in tempi brevi è quella che contiene i tumori più resistenti ai trattamenti terapeutici.

Questo quadro sintetico dei progressi conseguiti viene completato dai risultati della gran messe di studi sugli agenti cancerogeni, dove però i dati più probanti sono quelli qualitativi, data la grande difficoltà di riconoscere nell’uomo per via epidemiologica la risposta dose-effetto ad un determinato agente in presenza concomitante di altri agenti. D’altro canto, sono proprio queste conoscenze che permettono la protezione sanitaria, la prevenzione e il risanamento, come richiesto dalle comunità. Il sogno della ricerca è stato quindi sempre quello di ricondurre ad un quadro coerente e integrato il problema oncologico: riconoscimento precoce della comparsa dei tumori, prevenzione, diagnosi e prognosi, terapia e riabilitazione, sopravvivenza, condizioni di vita, risanamento se necessario.

L’analisi di Tomasetti e Vogelstein
In questo quadro si pone il lavoro citato, basato su un assunto tanto semplice e tanto strettamente legato alla biologia cellulare da risultare, per così dire, “ovvio” in termini fenomenologici. Sulla base dell’osservazione, nota da oltre un secolo, che diversi tessuti danno luogo a numeri estremamente diversi di tumori, l’assunto è che tale differenza, finora non spiegata, sia dovuto al numero totale di divisioni cellulari per il tessuto interessato e per  il relativo tipo di tumore (ossia il tessuto in cui avviene la trasformazione neoplastica da cui origina il tumore). Se il rischio è presente ad ogni divisione cellulare, allora il rischio complessivo è più alto se più sono le divisioni cellulari stesse. Questo numero di divisioni è a sua volta legato alle caratteristiche di proliferazione, rinnovamento e mantenimento dell’omeostasi di ciascun tessuto (cioè dell’equilibrio del numero di cellule necessarie ad un dato tessuto).

Conviene spiegare il meccanismo di base della proliferazione cellulare che permette la vita e il funzionamento di un organismo individuale. In termini semplici, il corpo umano – o meglio, il corpo di ogni organismo animale multicellulare – è una sorta di assemblaggio di organi (arti, polmoni, viscere, ecc.) a loro volta composti ognuno da alcuni tipi di tessuto formati ciascuno da una popolazione di un certo tipo di cellule.

Le popolazioni cellulari
E’ essenziale apprezzare le dimensioni popolazionistiche del fenomeno: il corpo umano è composto da un numero di cellule dell’ordine di grandezza di 5-10 trilioni, cioè 5-10 x 10¹² (in questo caso, si tratta solo delle cellule con genoma umano; il corpo contiene anche un numero dieci volte più alto di altre cellule, primariamente procarioti – simbionti, commensali, inquilini , parassiti, a seconda del loro rapporto con l’uomo – che per la maggior parte vivono nel sistema digerente), cifra ottenuta sulla base di osservazioni microscopiche e micrometriche. A questo valore si può arrivare anche per altra via: assumendo per un corpo adulto un peso tra 60 e 90 kg, considerando che la parte ossea non-cellulare è fra il 14% e il 20%, che la parte non-cellulare del sangue è di circa il 5% della massa corporea totale. La massa di una tipica cellula umana è di 1 nanogrammo, ossia 10^-9 g. Il risultato è di 46-68 trilioni, cifra compatibile con la precedente.

Una stima simile può essere ricavata utilizzando le dimensioni cellulari, misurabili con elettrovolumetria o citometria, che sono in genere caratterizzate da 10 micron di diametro di una quasi-sfera di qualcosa assimilabile all’acqua. In quest’ultimo caso, però, il calcolo è ancora più approssimato per la grande variabilità tra tipi di cellule ed a causa dei problemi di calcolo del volume per le cellule che non sono in forma vicina a quella sferica.

Il corpo umano è formato da un numero relativamente alto di organi: oltre sessanta.

I tipi di cellule, che costituiscono le diverse popolazioni cellulari che concorrono alla formazione e al funzionamento degli organi, sono molti di più:

- cellule derivate essenzialmente dall’endoderma: 27 tipi di cellule epiteliali a secrezione esocrina, 31 tipi di cellule secernenti diversi ormoni,

- cellule derivate essenzialmente dall’ectoderma: 12 tipi di cellule epiteliali cheratinizzanti, 3 tipi di cellule epiteliali a barriera stratificata, 22 tipi di cellule nervose, 12 tipi di cellule sensoriali e di supporto, 4 tipi di cellule neuronali e gliali, 2 tipi di cellule lenti,

- cellule derivate essenzialmente dal mesoderma: 3 tipi di cellule per il metabolismo e il deposito (epatociti, adipociti, lipociti), 17 tipi di cellule renali, 21 tipi di cellule produttrici di matrici extracellulari, 12 tipi di cellule contrattili, 21 tipi di cellule ematiche o con funzioni immunologiche, 5 stadi diversi di cellule germinali maschili e femminili, 3 tipi di cellule nutrici e uno di cellule renali interstiziali.

Il che fa l’alto numero di 195 popolazioni diverse, probabilmente una sottovalutazione: di queste, 9 popolazioni e tutta la famiglia delle progenitrici delle cellule del sangue e con funzioni immunologiche sono già          riconosciute come cellule staminali: ma queste popolazioni sono molte di più.

Si può capire, a questo punto, il meccanismo cellulare che governa il corpo individuale, le sue caratteristiche e la sua variabilità. Ogni nuovo organismo parte dallo zigote, la cellula formata per fusione nel processo meiotico della cellula padre con la cellula madre. Per definizione, lo zigote è una cellula staminale indifferenziata e totipotente, in quanto da cellule come questa deriveranno, per differenziazioni successive modulate dal DNA, le varie popolazioni costituenti gli specifici tessuti e organi. Si possono distinguere operativamente i diversi ruoli delle diverse cellule staminali.

Le cellule staminali
Le cellule staminali hanno la capacità di dare origine a cellule differenziate; esse possono anche mantenere la capacità a proliferare in modo da mantenere una riserva di cellule staminali da utilizzare in caso di necessità. Si possono quindi distinguere:

- le cellule staminali embrionali che contribuiscono alla crescita embrionale e possono regolarsi a seconda del fabbisogno (compreso il de-differenziamento e la proliferazione di lunga durata come cellule indifferenziate);

- le cellule staminali presenti nel cordone ombelicale, che sono in realtà cellule staminali emopoietiche (del sangue) adulte, ma che presentano il vantaggio di un prelievo facile e che non si presta a contenziosi etici;

- le cellule staminali dell’adulto, di cui quelle note:

            le cellule staminali e progenitrici del sistema immuno-ematico,

            le cellule staminali della linea germinale maschile (spermatogoni),

            le cellule staminali degli osteoblasti,

            le cellule staminali delle cellule satelliti muscolari,

            le cellule staminali della matrice dei capelli,

le cellule basali degli epiteli (cornea, lingua, cavità orale, esofago, canale anale, uretra distale, vagina),    

            le cellule epidermali cheratiniche,

            le cellule basali epidermali,

            le cellule basali delle unghie.

Come si può vedere, le cellule staminali sono presenti in modo differenziale nei diversi tessuti, indicando così l’esistenza di esigenze diverse per la varie popolazioni cellulari.

I tessuti secondo Bizzozero
E’ necessario quindi essere in grado di distinguere e descrivere lo stato proliferativo dei vari tessuti e la condizione relativa delle loro cellule staminali. Il quadro generale può essere interpretato alla luce del lavoro di un grande studioso italiano, pochissimo noto in patria, il medico istologo Giulio Cesare Bizzozero (1846-1901), allievo all’Università di Pavia di Paolo Mantegazza (1831-1910) e collega di Camillo Golgi (1843-1926), futuro premio Nobel. Educato in quella che allora era una delle più importanti università del mondo (in biomedicina, oltre a Golgi: Spallanzani, Scarpa, Aselli, Tissot, Frank, Bassi, Corti, Dubini, Sertoli, Negri, Veratti, Grassi, Carini; in fisica e matematica: scienziati del calibro di Cardani e Volta), fu uno dei primi medici a divenire uno scienziato moderno, contribuendo a diverse scoperte fondamentali:

l’ematopoiesi e il ruolo del midollo osseo nella produzione delle cellule del sangue, lo strato spinoso della pelle, la fagocitosi, le piastrine. Finalmente, a valle del lavoro di Walther Flemming (tra il 1874 e il 1882) sulla divisione cellulare, Bizzozero dette il contributo fondamentale sul sistema dei tessuti, che riconobbe come classificabili in termini di proliferazione cellulare (con la frazione di cellule mitotiche come indice delle capacità di proliferazione e rigenerazione):

- tessuti labili, in continua riproduzione per la necessità di rimpinguare nel corso della vita le cellule consumate continuamente: midollo osseo e milza, diverse ghiandole (testicolo, ovaio, linfonodi, ghiandole sebacee), epidermide, sistema gastro-intestinale;

- tessuti stabili, con riproduzione solo fino alla nascita o poco dopo o in particolari situazioni patologiche: fegato, ossa, muscolatura liscia;

- tessuti perenni, capaci di riproduzione solo nel periodo embrionale: sistema nervoso, muscolatura striata.

In base a questo quadro disegnato da Bizzozero, emergeva chiaramente il ruolo della proliferazione e del differenziamento cellulare nel determinare per ciascun tessuto le caratteristiche funzionali e riproduttive. Di fatto, pur senza nominarle, erano state introdotte nel quadro anche le cellule staminali (il termine “cellule staminali” è stato introdotto da Alexander Maksimov nel 1908. L’unico importante ritocco a quanto indicato da Bizzozero è stato che anche nei tessuti perenni – e in particolare nel tessuto nervoso (Altman, 1962) - viene mantenuto il potenziale per la divisione cellulare in determinate conduzioni. La relazione divisione cellulare > proliferazione cellulare > ripopolamento è un dogma che continua a reggere.

La proliferazione cellulare
Nel periodo immediatamente successivo alla Seconda guerra mondiale, importanti progressi metodologici e sperimentali hanno permesso di meglio chiarire il ruolo della proliferazione cellulare nei tessuti. Nel 1953, Howard & Pelc, per la verità su tessuti vegetali di Vicia faba (ma i meccanismi sono gli stessi), utilizzando una sostanza radioattiva con cui marcare un precursore degli acidi nucleici necessari alla riproduzione cellulare (la timidina marcata con il tritio, isotopo radioattivo dell’idrogeno), furono in grado di distinguere le cellule effettivamente proliferanti ed in queste un ciclo cellulare che si articola in diverse regioni/periodi morfologico-funzionali (G1, S, G2, M) della divisione cellulare. I vari tessuti, caratterizzati in termini di proliferazione, vengono anche caratterizzati in termini di clonogenicità, cioè di proliferazione “indefinita”, ossia di capacità di rigenerazione, riparazione e ripopolamento. Questo approccio fu completato trattando diverse popolazioni clonogeniche, o meglio le popolazioni di cellule staminali che sono i loro precursori, con radiazioni ionizzanti: i risultati dimostrano chiaramente che la radiosensibilità è collegata alle caratteristiche della popolazione cellulare di un dato tessuto ed al suo livello di proliferazione. Gli studi vennero condotti su animali, poi su tessuti umani, su sistemi tumorali, e su sistemi in vitro:

- cellule emopoietiche murine (1959)

- cellule di linfoma murino (1960)

- cellule dell’epidermide murina (1967)

- cellule delle cripte della mucosa intestinale murina (1967)

- cellule dell’epidermide umana (in radioterapia, 1980)

- cellule dei testicoli del topo

- cellule dei tubuli renali del topo

- metastasi polmonari

- metastasi epatiche

Curva di crescita di tipo Gompertziano di una popolazione di cellule tumorali. Una curva simile si osserva per una popolazione coltivata in vitro o per un tumore in vivo.  

Una particolare similitudine viene riscontrata tra le cellule staminali degli individui adulti e le cellule coltivate in vitro quando queste subiscono una “trasformazione” e diventano una linea capace di crescere in coltura “indefinitamente” mediate una risemina di coltura in coltura (oppure mediante tecniche di diluzione continua delle cellule nel terreno liquido).  Le discussioni per cercare di verificare se vi fosse per le popolazioni in vitro un “mitico” numero massimo di generazioni (superabile solo dalla trasformazione in sistema neoplastico) simile a quello esistente nell’organismo in vivo non hanno portato a conclusioni certe. Alcuni classici ed eleganti esperimenti sul riuso di terreni di coltura hanno suggerito l’esistenza di più di un meccanismo che controlla il numero di cellule di una popolazione in coltura: uno legato all’esaurirsi di qualche sostanza nutritiva nel terreno; uno controllato dal numero di cellule con la comparsa di sostanze inibitrici della crescita (nome generico: caloni) che causano l’entrata graduale delle cellule in una fase stazionaria (messa in evidenza da un plateau nella curva di crescita o da un andamento Gompertziano nella curva); uno legato al numero di generazioni.   

In questo quadro complesso, le cellule staminali nell’adulto e le cellule in vitro sono entrambe state usate come sistemi clonogenici, ossia come unità di popolamento o ripopolamento che permettono così di studiare il fenomeno della morte riproduttiva, a sua volta legato ai fenomeni di mutagenesi e carcinogenesi. Così, confermando le osservazioni condotto da Bergonie e Tribodeau fin dal 1906, negli anni ’60, dopo una gran messe di studi sugli effetti delle radiazioni ionizzanti (International Congress of Radiation Research, Cortina d’Ampezzo, 1966), vennero riconosciute delle regole generali empiriche sulla risposta alle radiazioni ionizzanti o anche ad agenti chimici citotossici e citostatici: le cellule proliferanti che si trovano nelle fasi del ciclo più rilevanti per i processi di mitosi e rigenerazione cellulare (S) sono più (radio)sensibili delle cellule in altre fasi; le cellule in crescita logaritmica sono più sensibili di quelle in fase stazionaria; le cellule proliferanti sono più sensibili delle cellule non-proliferanti; le cellule dei tessuti labili sono le più sensibili. 

Formazione nella milza di topo di colonie da cellule staminali emopoietiche.

Rischio di cancro e cellule staminali
Vi sono chiaramente analogie tra questo quadro della proliferazione cellulare e quanto notato da Tomassetti & Vogelstein – che il rischio di cancro nel corso della durata della vita è correlato al totale di divisioni cellulari delle cellule staminali e quindi al livello di proliferazione che mantiene l’omeostasi del tessuto. L’omeostasi è peraltro un meccanismo necessario per i tessuti sottoposti a “consumo”, come l`epidermide in desquamazione o espulsione di forfora, o la mucosa intestinale per i fenomeni di secrezione e di assorbimento; il rinnovo di questi tessuti è necessario non solo in termini di numero di cellule ma di mantenimento della “forma” dell’organo coinvolto.

E vi sono altresì analogie tra la radiosensibilità di alcuni tessuti e la sensibilità all’insorgenza di mutazioni somatiche casuali. In altre parole, nell’individuo, le mutazioni casuali che possono causare neoplasie appaiano in aumento nei tessuti proliferanti. Dal complesso dei dati per i tessuti normali emerge che 2/3 dei tumori sono dovuti al caso (sfiga) mentre solo il rimanente terzo è attribuibile a fattori ambientali ed alla predisposizione ereditaria (compresi fattori tissutali o immunologici in grado di eliminare cellule mutate prima dell’insorgenza del tumore).

Un esempio è quello dei tumori intestinali: nel colon si stima che avvengano circa 10¹² divisioni di cellule staminali della mucosa nel corso di una vita, mentre nel duodeno sono solo 10¹⁰: e infatti il rischio di tumore nel corso della vita è di 10^-1-10^-2 per il carcinoma del colon-retto e di circa 10^-4per il carcinoma del duodeno. Questo per l’uomo, mentre per il topo, dove i valori sono praticamente invertiti, lo stesso avviene per i tumori, con il rischio del duodeno che diventa il principale.

Numero totale di divisioni di cellule staminali in un tessuto verso rischio di tumore nello stesso tessuto per la durata della vita. (da Tomasssetti & Vogelstein, Science 347: 78-81, 2015) 

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